引言

在上一期的文章中，我们深入探讨了双诱导仓鼠（金黄地鼠）肝S9在药物毒理学研究中的核心价值，特别是其在亚硝胺类候选化合物遗传毒性评估中的不可替代性。然而，一套高质量的代谢活化系统只是加强Ames试验成功的一半。如何为亚硝胺类化合物选择合适的阳性对照（Positive Control），同样是确保试验结果可靠、合规的关键环节。

本文将系统阐述加强Ames试验（Enhanced Ames Test, EAT）中小分子亚硝胺类阳性对照的选择原则，并提供基于最新研究数据和监管指南的实操建议。

一、为什么亚硝胺类需要“专门的"阳性对照？

在传统的Ames试验中，阳性对照通常选用2-氨基蒽（2-AA）、苯并[a]芘（BAP）等标准致突变物，用于验证S9代谢活化系统的活性。然而，当评估亚硝胺类化合物时，情况发生了变化（详见图1）。

（图1：亚硝胺类阳性对照在加强Ames试验中的作用示意图）

亚硝胺是一类前致突变物（pro-mutagen），需要在肝脏中被CYP450酶系（主要是CYP2E1和CYP2C19）代谢活化后才能产生致突变活性。传统的阳性对照（如2-AA）虽然也能被S9活化，但其代谢途径和酶谱需求与亚硝胺类存在显著差异。使用与受试化合物代谢特征相匹配的阳性对照，才能更准确地验证S9系统对亚硝胺类化合物的代谢活化能力。

EMA在关于亚硝胺杂质的指南中明确指出[7] ，加强Ames试验应包含两个亚硝胺类阳性对照，最好根据待测亚硝胺的预期代谢特征进行选择。这标志着亚硝胺类阳性对照的选择已经从“通用型"转向了“靶向型"。

二、亚硝胺类阳性对照的推荐清单

综合近年来多项关键研究数据（包括FDA优化研究、HESI国际合作环试研究以及2025年发表的综述分析）[1][4]，以下化合物已被确认为适合在加强Ames试验中作为阳性对照使用的亚硝胺类物质。

2.1 核心推荐：NDMA 和 NDEA

NDMA和N-亚硝基二乙胺（NDEA）是短链烷基亚硝胺中较具代表性的两个成员，也是目前在加强Ames试验中使用最为广泛的阳性对照。

一项系统研究对NDMA和NDEA的Ames试验检测参数进行了定性与定量分析，发现两者的致突变性可以在Ames试验中轻松检出，且最敏感的参数组合包括：30分钟预孵育法、水或甲醇作为溶剂、诱导仓鼠肝S9，以及TA100、TA1535和WP2 uvrA(pKM101)菌株。[1]

值得注意的是，NDMA在不同菌株中表现出差异化的反应特征——在WP2 uvrA(pKM101)菌株中活性更高，而NDEA和CPNP则在TA1535和TA100菌株中更为活跃。[2] 因此，建议将NDMA和NDEA作为“菌株覆盖型"阳性对照组合使用，以全面验证不同突变检测系统对亚硝胺类化合物的响应能力。[3]

2.2 扩展推荐：NDPA 和 NDBA

除了NDMA和NDEA之外，研究还发现N-亚硝基二丙胺（NDPA）和N-亚硝基二丁胺（NDBA）也是合适的亚硝胺类阳性对照选项。一项发表于2024年的比较研究明确指出，NDEA、NDPA和NDBA均可作为加强Ames试验中额外的亚硝胺阳性对照使用。[1]

在实际应用中，使用10%诱导大鼠S9或10%诱导/未诱导仓鼠S9即可检测到NDEA、NDPA和NDBA的致突变活性。这为实验室在阳性对照选择上提供了更大的灵活性。

三、阳性对照的选择策略与浓度优化

3.1 基于待测化合物特征的分层选择策略

建议采用以下分层策略来选择阳性对照(详见图2和表3）

（图2：亚硝胺类阳性对照分层选择策略流程图）

（表2：基于待测化合物特征的分层阳性对照选择策略）

3.2 S9浓度对阳性对照响应的影响

S9浓度的选择直接影响阳性对照的响应强度，进而影响试验的有效性判定。多项研究得出一致结论：30%仓鼠S9产生的致突变响应高于10% S9。[1][4]

一项涵盖29种亚硝胺和17种NDSRI的大规模优化研究显示，使用TA1535和WP2 uvrA(pKM101)菌株组合、30分钟预孵育、以及含30%仓鼠肝S9的S9混合液，即可检测到全部18个阳性亚硝胺。[4]

对于NDMA，研究发现使用20%大鼠S9或10%仓鼠S9即可检测到显著突变频率。但需要警惕的是，过高的S9浓度可能对细菌产生细胞毒性，导致突变频率降低。研究建议将S9含量控制在10%即可获得可靠结果，这同时符合3R原则。在实际操作中，建议采用双浓度策略——使用10%和30%两种S9浓度分别进行测试，以兼顾灵敏度与细胞毒性控制。[1]

四、阳性对照的浓度范围与溶剂选择

4.1 推荐浓度范围

根据现有研究数据，亚硝胺类阳性对照在Ames试验中的推荐浓度范围如下（详见表3），具体浓度需根据实验室历史数据和方法验证结果进行微调[5] 。

（表3：亚硝胺类阳性对照在Ames试验中的推荐浓度范围）

4.2 溶剂选择

溶剂的选择对试验结果有显著影响（详见表4），研究表明[5] ，N-甲基-2-吡咯烷酮（NMP）和乙酸乙酯等溶剂即使在较低剂量下也会抑制S9酶的活性。相比之下，二甲基亚砜（DMSO）在高达1.6%（v/v）的浓度下仍表现出良好的兼容性，且溶解能力强、细胞毒性低，因此被推荐为亚硝胺EAT的推荐溶剂。水也被证明是兼容的溶剂。 

（表4：亚硝胺类阳性对照在Ames试验中的推荐溶剂与注意事项）

4.3 纯度要求

为避免假阳性结果，所用阳性对照化合物应通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）确认高纯度（>98%）。此外，研究中还可采用谷胱甘肽共孵育策略，以淬灭过量的烷化剂，确保检测到的是真实的致突变信号而非非特异性烷化作用。

五、阳性对照在加强Ames试验中的质量控制作用

加强Ames试验与传统Ames试验在试验设计上存在多个关键差异[6][8] （详见表5） ：

（表5：传统Ames试验与加强Ames试验（针对亚硝胺）的关键参数）

阳性对照在加强Ames试验中承担着以下关键质量控制功能[2] （详见表6）：

（表5：传统Ames试验与加强Ames试验（针对亚硝胺）的关键参数）

六、实操建议与常见问题

Q1：如何确认阳性对照试验结果是有效的？

阳性对照组的回复突变菌落数应达到阴性对照组的3倍以上，且该效应应在多个剂量点呈现剂量-反应关系。同时，应建立实验室内部的历史数据范围（均值±2SD），用于日常结果判定。

Q2：如果NDMA和NDEA的响应信号都很弱，可能是什么原因？

可能原因包括：（1）S9混合液中仓鼠S9浓度不足或批次活性较低；（2）预孵育时间不足（应确保30分钟）；（3）溶剂对S9酶活性产生抑制；（4）阳性对照溶液配制有误或已降解。建议首先使用10%和30%仓鼠S9进行平行测试以排查S9相关因素。

Q3：对于NDSRI类杂质，如何选择合适的阳性对照？

对于NDSRI类杂质，EMA建议基于待测NDSRI的预期代谢特征来选择阳性对照。如果缺乏直接匹配的阳性对照，可以组合使用NDMA/NDEA作为基础阳性对照，同时选用一个结构相似、已知具有致突变活性的NDSRI作为补充阳性对照。

Q4：阳性对照的批次间差异如何处理？

建议每批新的阳性对照溶液与历史批次进行平行测试，确保响应强度在历史数据范围内。阳性对照应分装保存，避免反复冻融导致降解。

七、齐氏生物配套解决方案

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结语

在加强Ames试验中，亚硝胺类阳性对照的选择并非简单的“拿来主义"。科学、合理的阳性对照选择策略，是确保S9代谢活化系统有效性验证准确性的基石，也是满足EMA、ICH M7(R2)等监管要求的关键环节。

NDMA和NDEA作为经典的短链烷基亚硝胺阳性对照，是开展亚硝胺类杂质遗传毒性评估的基础选项；NDPA和NDBA可作为扩展选择，提供更广泛的代谢覆盖。结合30%仓鼠肝S9、30分钟预孵育以及TA1535/WP2 uvrA(pKM101)敏感菌株组合，可以较大化加强Ames试验的检测灵敏度。

齐氏生物将持续为您提供专业的亚硝胺类阳性对照选择建议和技术支持，助力您的药物杂质风险评估工作精准、高效、合规！

参考文献

[1] Dieckhoff J, Bringezu F, Simon S. Metabolic activation of short-chain alkyl N-nitrosamines using Aroclor 1254 or phenobarbital/beta-naphthoflavone-induced rat or hamster S9 – A comparative analysis[J]. Toxicology Reports, 2024, 12: 215-223.

[2] Bringezu F, Simon S. Salmonella typhimurium TA100 and TA1535 and Escherichia coli WP2 uvrA are highly sensitive to detect the mutagenicity of short alkyl-N-nitrosamines in the bacterial reverse mutation test[J]. Toxicology Reports, 2022, 9: 250-255.

[3] Shukla RM, Valani DT, Kajavadara CK, et al. Comparative analysis of TA102 and WP2 uvrA(pKM101) strains in detecting nitrosamine mutagens in the enhanced Ames test[J]. Environmental and Molecular Mutagenesis, 2025, 66(5): 291-297.

[4] Bercu J, et al. HESI GTTC ring trial: Concordance between Ames and rodent carcinogenicity outcomes for N-nitrosamines (NAs) with rat and hamster metabolic conditions[J]. Regulatory Toxicology and Pharmacology, 2025, 161: 105835.

[5] Kajavadara CK, Patel SN, Shukla RM, et al. Selection of solvent and positive control concentration for enhanced Ames test conditions for N-nitrosamine compounds[J]. Regulatory Toxicology and Pharmacology, 2024, 152: 105711.

Kajavadara CK, Valani DT, Patel SN, et al. Strain-specific mutagenicity of NDMA and CPNP: insights from TA1535, TA100, and WP2 uvrA(pKM101) under metabolic activation[J]. Environmental Toxicology and Pharmacology, 2025, 117: 104752.

[7] European Medicines Agency. Enhanced Ames test conditions for N-nitrosamines; Appendix 3 to Questions and answers for marketing authorisation holders/applicants on the CHMP Opinion for the Article 5(3) of Regulation (EC) No 726/2004 referral on nitrosamine impurities in human medicinal products (EMA/120337/2024)[S]. 2024.

[8] OECD. Test No. 471: Bacterial Reverse Mutation Test (Ames test)[S]. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Publishing, Paris, 2020.

本期是「代谢π析·仓鼠S9专题」的第2篇，系统梳理了加强Ames试验中NDMA、NDEA等小分子亚硝胺阳性对照的选择策略。下一期我们将继续深入探讨一类更复杂的亚硝胺杂质——NDSRI（原料药相关亚硝胺杂质），欢迎持续关注！